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연구 보고서
중장기적인 정책연구과제와 대안을 포괄적인 시각에서 이론적 · 실중적 분석을 통해 제시함으로써 연구원의 설립목표를 가장 잘 실행하고있는 보고서입니다.
화학물질 노출에 의한 유전자돌연변이(발암)의 조기 확인(II) -실험동물을 이용한 고감도 발암성 확인기법의 검증
- 연구책임자
- 임경택 외 1명
- 수 행 연 도
- 2016년
- 핵 심 단 어
- 주 요 내 용
- , 1. 연구제목 화학물질 노출에 의한 유전자 돌연변이(발암)의 조기 확인(II) (실험동물을 이용한 고감도 발암성 확인기법의 검증) 2. 연구 필요성 및 목적 본 연구에서는 만성발암성시험 진행 중 동물의 발암여부를 확인하기 위해 최종 부검을 하는데, 그 이전의 노출단계에서 혈액 채취만으로 유전자의 발암성 돌연변이를 확인함으로써 지속가능한 분자생물학적 대체시험법으로 확립하고자 하였으며, 2년차 연구로 실험동물의 혈액에서 발암관련 돌연변이 발생여부를 확인할 수 있도록 검출한계를 높인 검사기법을 확인하고자 하였다. 3. 연구내용 및 방법 가. 유전자 돌연변이(발암)를 유도하는 화학물질에 대한 자료 수집 나. 실험동물의 선택, 구입 및 사육과 발암유도 화학물질의 투여 및 시험동물 시료의 채취 다. 조직 및 혈액 샘플로부터 gDNA 및 cfDNA 추출 라. Whole Exome Sequencing 분석 기반 유전자 돌연변이 서열 분석 마. 유전자 돌연변이 특이적 증폭을 위한 PNA probe 기반의 Enrichment 방법 확립 바. 고민감도 NGS 기술 기반 조직 샘플에서 추출한 gDNA를 이용한 유전자 변이 검출 사. 고민감도 NGS 기술 기반 혈액 샘플에서 추출한 cfDNA를 이용한 유전자 변이 검출 아. 추가실험(소핵시험 및 조직병리검사) 4. 연구결과 가. 유전자 돌연변이(발암)를 유도하는 화학물질에 대한 자료 수집 * 1차(2015)년도에 폐암관련 유전자들의 변이를 분석하고 검출하기 위해 선정한 ATCCTM1) 상피샘종(Lung epithelial adenoma)인 폐암 세포주(ATCCⓡ CCL-196TM)는 8주령의 A/He 마우스에 20 ㎎/마리의 우레탄(Urethane) 복강(i.p.) 투여 20주 후에 폐에 생성된 암세포였음(Gary etal., 1975)에 착안하여, 2차(2016)년도의 in vivo 검증연구에서 사용할 발암유도 화학물질로 우레탄(Ethyl carbamate, CAS No. 51-79-6)을 선정하여 사용하였다. 나. 실험동물의 선택, 구입 및 사육 * 본 연구에 시험에 사용한 실험동물은 SPF(specific pathogen free)의 설치류 ICR 계통의 수컷 마우스를 사용하였으며, 선정사유는 1차년도에 사용한 세포주가 마우스 세포주였으므로 이의 연장으로 in vivo에서도 마우스를 사용하였으며, 또한 ICR 마우스는 소핵시험에서 일반적으로 사용되는 종으로 소핵시험에 대해 보고된 자료가 많다. 다. 발암유도 화학물질의 투여 * 본 연구에서 실험동물에 투여한 발암유도 화학물질인 우레탄(CAS No.51-79-6, Aldrich, 94300-50g, USA; MW 89.09)은 1.00 mg/g b.w.(1,000mg/kg b.w.), 10 ml/kg b.w.(0.1 ml/10 g b.w.)의 용량으로 투여하였으며, 1) ATCCTM(American Type Culture Collection), www.atcc.org. 동 물질을 생리식염수(0.9% NaCl)에 희석하여 사용하였다. 투여방법은, 대조군 6마리에는 생리식염수를 복강투여하였고, 실험군 18마리에는 우레탄 1,000 mg/kg b.w.을 투여하였다. 라. 시험동물 시료의 채취 * 본 연구에서는 동물시료의 채취 방법으로 실험동물에 발암유도 화학물질의 투여 후 2주차에 대조군 2마리(1001-1002) 및 실험군 6마리(1101-1106)를, 투여 6주차에 대조군 2 마리(1003-1004) 및 실험군 6 마리(1201-1206)를, 투여 12주차에 대조군 2마리(1005-1006) 및 실험군 6 마리(1301-1306)를 안락사 시킨 후, 추후 실험에 사용할 동물시료인 전혈(Whole blood), 폐(Lung) 및 골수(Bone marrow)를 채취하였다. 마. NGS+InsightOnco 검증시험(외부시험 의뢰) * 조직 및 혈액 샘플로부터 gDNA 및 cfDNA 추출 * Whole exome sequencing 분석 기반 유전자 돌연변이 서열 분석으로 표적 유전자인 Cdkn2a 및 Vegfa 선별 * 유전자 돌연변이 특이적 증폭을 위한 PNA probe 기반의 enrichment 방법 확립 * 고민감도 NGS 기술 기반 조직 샘플에서 추출한 gDNA에서 표적 유전자인 Cdkn2a 및 Vegfa 유전자의 변이 검출 * 고민감도 NGS 기술 기반 혈액 샘플에서 추출한 cfDNA에서 표적 유전자인 Cdkn2a 및 Vegfa 유전자의 변이 검출 * 이상의 결과로 PNA 탐침자 기반 mutant enrichment 방식의 NGS 분석을 통해 표적 유전자인 Cdkn2a 및 Vegfa 유전자의 변이를 검출일반 NGS분석에서는 탐색하기 어려운 1% 이하도 검출이 가능하였고, 혈액 내 적은 양으로 존재하는 암유전자 돌연변이를 일반 NGS 분석으로는 검출할 수 없는 반면 PNA 탐침자 기반 mutant enrichment 방식의 NGS 분석을 통해 검출하였으며, 조직과 비교하여 일치하게 존재한다는 사실을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 실험동물의 부검 없이 혈액검사만으로 혈액 내 적은 양으로 존재하는 암유전자 돌연변이를 검사함으로써 발암여부를 확인할 수 있을 것으로 예상된다. 바. 기타 실험동물의 골수세포를 이용한 생체 내(in vivo) 소핵시험 및 조직 병리시험(임상병리부에 의뢰)을 수행하였다. 5. 활용방안 및 기대성과 동물의 부검 없이 화학물질 노출 중에 혈액을 채취하는 것만으로 발암여부를 확인할 수 있는 새로운 기술의 개발로 발암성 및 변이원성에 대한 새로운 시험법을 확립하고자 하였으며, 1차～2차년도 연구 수행을 통해 극미량 검출한 계를 갖는 유전자 돌연변이 검사기법을 도입하여 만성발암성 흡입독성시험 등에 적용하고자 하는 것이 목표로서, 이중 1차년도에 수행하였던 세포주를 이용한 유전자 돌연변이의 고감도 검출기법을 실험동물에서 확인 검증하였으며, 국제기관 및 국내 비임상 발암성 대체시험법(안) 등으로 제안할 수 있으며, 국내외 우수 학술지 논문게재 및 학회에서 발표하고, 관련 원천기술의 특허 출원 등을 할 수 있을 것으로 판단된다. 6. 중심어 화학물질, 돌연변이, 조기 확인, 실험동물, PNA 탐침자, 검출한계, 차세대염 기서열분석(NGS) 약어의 정리(Abbreviations) NGS : Next Generation Sequencing PNA : Peptide Nucleic Acid gDNA : genomic DNA cfDNA : cell free DNA PCR : Polymerase Chain Reaction SNP : Single Nucleotide Polymorphism Indel : Insertion and Deletion Cdkn2a : Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A gene Vegfa : Vascular endothelial growth factor A gene 7. 참고문헌 및 연락처 가. 참고문헌 ？통계청. 2006년 사망원인 통계결과. ？한규태, 조명행, 양혜영 등. 만성흡입독성시험센터 구축 타당성 연구. 2009년 산업안전보건연구원 연구용역과제 최종보고서 ？Ardizzoni A, Cafferata MA, Tiseo M et al. Decline in serum carcinoembryonic antigen and cytokeratin 19 fragment during chemotherapy predicts objective response and survival in patients with advanced nonsmall cell lung cancer. Cancer 2006;107:2842-2849. ？Aviel-Ronen S, Blackhall FH, Shepherd FA et al. K-ras mutations in non-small-cell lung carcinoma: a review. Clin Lung Cancer 2006;8:30-38. ？Barak V, Goike H, Panaretakis KW, Einarsson R. Clinical utility of cytokeratins as tumor markers. Clin Biochem 2004;37:529-540. 나. 기타 인터넷 사이트 ？Comparative Toxicogenomics Database[serial online] 2016 Nov [cited 2016 Nov 16]. Available from: URL:http://ctdbase.org/ ？dbSNP, Short Genetic Variations[serial online] 2016 Nov [cited 2016 Novvi … 화학물질 노출에 의한 유전자 돌연변이(발암)의 조기 확인(II) ▶ 연구책임자：화학물질독성연구실 임경택 연구위원 ▶ 연구원 담당자：산업안전보건연구원 화학물질독성연구실 임경택 연구위원
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