연구 보고서
중장기적인 정책연구과제와 대안을 포괄적인 시각에서 이론적 · 실중적 분석을 통해 제시함으로써 연구원의 설립목표를 가장 잘 실행하고있는 보고서입니다.
천연 항산화물질의 직업성 심장질환 예방효과 연구-심근세포 유전자 생체지표 발현의 조절-
- 연구책임자
- 임경택,김수진
- 수 행 연 도
- 2011년
- 핵 심 단 어
- 주 요 내 용
- , 1.연구 필요성 및 목적 ○ 최근,식이 또는 약용으로부터 유래하는 독성이 없는 안전한 항산화물질을 이용하여 질병의 조기예방 및 건강증진에 대한 관심이 질병예방 연구의 새로운 전략으로 대두되고 있고,강력한 항산화력을 갖는 epigallocatechin-3-gallate(EGCG)등의 천연 항산화물질은 암예방제로서 주목받고 있어 활성산소로 인한 직업성 심장질환의 예방에도 탁월한 효과가 기대된다. ○ 화학물질의 사용으로 발생하는 심장질환을 식이 또는 약용식물 등으로부터 유래하는 안전한 항산화물질을 이용하여 효율적인 조기예방 및 질병예방 연구가 필요하였다. ○ Epigallocatechin-3-gallate (EGCG), Docosahexaenoic acid(DHA),Eicosapentaenoicacid(EPA)같은 PUFA(다중불포화지방산)및 Selenium 등의 천연 항산화물질은 심장세포에서도 산화적 손상 및 염증반응 예방에 효과가 기대됨을 근거로 심장독성 의심물질로 인한 심근세포의 산화적 DNA손상 및 염증반응 유전자발현 조절에 항산화물질의 효과(분자생물학적 기전)를 상호비교ㆍ검증하고자 하였다. 2.연구내용 및 방법 (1)연구내용 및 범위 ○ 심근세포의 산화적 DNA 손상 및 염증반응 조절에 대한 천연 및 나노 항산화물질의 효과(세포생물학,유전독성학적)확인 ○ 심근세포의 신호전달체계 관련 유전자 발현변화에 미치는 천연 및 나노 항산화물질의 효과에 대한 분자생물학적 확인 (2)연구방법 ○ 직업성 심장질환 의심물질(1,1,1-Trichloroethane;TCEtn)구입 ○ 천연 항산화물질(Sodium selenite(Na2SeO3))물질구입 및 나노물질(Cerium oxide(CeO2)nanoparticle)구입 ○ 심근세포(heartmyoblast;H9c2(2-1))구입 및 배양 ○ 심근세포 염증반응 및 발암과정의 촉진,억제에 관련된 유전자(adenylate kinase-1, cyclooxygenase-2, PPAR-γ, MAPKinase,NF-κB,Kcnh2,microRNA)의 발현조절 분석 (real-timeRT-PCR) ○ 심근세포의 산화적 DNA 손상에 미치는 천연 항산화물질의 영향 분석 (Fpg/EndoIIIFLARE assay) ○ 심장독성예상 화학물질에 의한 심근세포독성(생존율),염증반응에 관련된 상호 신호전달 분자로서 중요한 유전자들의 발현에 천연 및 나노항산화물질이 어떻게 조절하는지 고찰하였다. 3.연구결과 ○ 세포주에 처리되는 CeO2 나노입자의 형태와 크기의 확인을 위해 1μM에서 100mM 까지의 농도구간에서 CeO2 나노입자의 크기가 100㎚ 이하인지 확인하였으며,각 농도조건에서 분산처리에 의한 CeO2 나노입자의 크기분포를 나타내었다.모든 농도에서 100 ㎚ 이하의 정규분포곡선형을 나타냈다. ○ Na2SeO3 및 CeO2 나노입자를 각 농도별로 전처리하고 1시간 후에 1,1,1-trichloroethane을 각각 10,100,1,000μM 농도로 처리하여 세포독성의 차이를 측정한 결과,24시간 전처리 시험에서의 결과와 유사한 결과를 볼 수 있었으며,Na2SeO3의 경우 1,000μM 이상의 농도에서 통계적으로 유의한 세포독성을,10μM Na2SeO3를 전처리하고 1시간 후 1,000μM 1,1,1-trichloroethane을 처리하였을 때도 통계적으로 유의한 세포독성의 증가를 보였다.1,000μM CeO2 나노입자를 1시간 전처리하고 100μM과 1,000μM 1,1,1-trichloroethane을 처리하였을 때도 통계적으로 유의한 세포독성의 증가를,10,000μM CeO2 나노입자 전처리시에는 세 가지(10,100,1,000μM 1,1,1-trichloroethane) 농도 모두에서 통계적으로 유의한 세포독성을 보였다.이상의 결과로, Na2SeO3와 CeO2 나노입자에서 모두 100 μM 이하의 농도에서 1,1,1-trichloroethane의 세포독성을 극복 내지는 감소시키는 것으로 관찰되었고,이는 1,000μM 이상 높은 농도의 Na2SeO3 및 CeO2 나노입자 전처리 및 전처리시간이 길어짐에 따라 특히 Na2SeO3 전처리에서 오히려 세포독성이 증가되는 것으로,셀레늄 자체의 만성노출 독성이 나타난 것으로 판단하여 이후의 시험에서 항산화예상물질의 전처리 시간은 1시간으로,Na2SeO3는 100μM 이하에서,CeO2 나노입자는 세포독성이 약간 감소한 구간인 1～100μM에서 수행하였다. ○ H9c2심근세포에서 시험물질로 인한 염증 및 발암관련 유전자들의 발현에 각 항산화예상물질들이 미치는 영향을 알아보기 위해,바이오마커를 선정,그 유전자를 invitroreal-timeRT-PCR로 증폭, 각 유전자에 대한 mRNA 발현정도의 차이를 관찰한 결과, cyclooxygenase-2의 경우 6시간에서는 거의 변화가 없었고,12시간에서 시험물질(TCEtn)에 의해 음성대조군보다 통계적으로 유의하게 (2배 이상)up-regulation되었다가,24시간에서는 시험물질 처리 및 Na2SeO3와 CeO2 나노입자의 처리로도 음성대조군보다 상당히 down되었다.36시간에서는 음성대조군과 거의 발현변화가 없었다.PPAR-γ의 경우는 6시간부터 24시간까지는 음성대조군과의 차이가 거의 없는 발현정도를 보이다가,36시간 처리시험에서 시험물질(TCEtn)에 의해 2.02배,100μM Na2SeO3 전처리 후 시험물질 처리로 통계적으로 유의하게 증가(2.73배),Na2SeO3의 전처리 후 시험물질 처리로 2.34배 up-regulation되는 발현양상을 보였다. ○ 핵내 DNA의 손상지표인 단일사슬 절단(singlestrand breakage)의 확인을 위해 alkalineSCGE (Comet)assay및 활성산소의 생성으로 인한 DNA 손상인 산화적 DNA손상 (oxidative DNA damage)의 확인을 위해 Fpg/EndoⅢ FLARE assay를 실시한 결과, olive tail moment의 경우, 6시간 처리군에서는 100 μMNa2SeO3의 동시처리로 EndoⅢ 특이적 산화적 DNA손상이 통계적으로 유의하게 증가,12시간 처리군에서는 1μM CeO2의 동시처리로 EndoⅢ 특이적 산화적 DNA손상이 통계적으로 유의하게 대폭 증가하였다.10 μM CeO2의 동시처리로 단일사슬 절단 및 EndoⅢ 특이적 산화적 DNA손상이 통계적으로 유의하게 대폭 증가하였고,100μM Na2SeO3의 동시처리로도 통계적으로 유의한 단일사슬 절단의 증가 및 Fpg와 EndoⅢ 특이 산화적 DNA손상이 대폭 증가하였다.24시간 처리군에서는 1 μM CeO2의 동시처리로 단일사슬 절단이 통계적으로 유의하게 대폭 감소하였으나 Fpg 특이 산화적 DNA손상이 증가하였다.10 μM CeO2의 동시처리로는 단일사슬 절단이 더욱 통계적으로 유의하게 감소하였다.36시간 처리군에서는 1μM CeO2의 동시처리로 Fpg 특이적 산화적 DNA손상이 통계적으로 유의하게 대폭 감소하였고,10 μM CeO2의 동시처리로 단일사슬 절단,Fpg 및 EndoⅢ 특이적 산화적 DNA손상이 모두 통계적으로 유의하게 대폭 감소하였다.항산화물질로 예상되는 CeO2의 동시처리시 처리시간의 증가 및 처리농도의 증가에 따라 산화적 DNA손상,특히 EndoⅢ 특이 산화적 DNA손상이 통계적으로 유의하게 감소하는 것으로 나타났다.Na2SeO3의 경우 12시간을 초과하는 장시간 처리에서는 오히려 세포독성이 증가되는 경향을 보여 24시간 이상 처리한 FLARE assay를 실시하지는 않았지만,이 물질의 동시처리에 의한 12시간까지의 OTM 및 TL의 변화추이를 보았을 때 오히려 산화적 DNA손상을 더욱 증가시킬 것으로 예상된다.본 시험에서는 상대적 기준물질인 Na2SeO3보다 CeO2가 더욱 강한 항산화제로서의 기능을 보였다. 4.활용 및 기대효과 ○ 소규모 사업장에서 다량 취급하는 유해화학물질에 의한 심장독성(산화적 DNA 손상 및 염증반응)확인 -심장독성이 강하게 의심되나 관련 시험자료가 부족한 물질 ○ 심근세포의 산화적 DNA 손상 및 염증반응의 효과적인 예방효과에 대한 천연 및 나노 항산화물질의 적용가능성 검증 ○ 직업성 심장질환,직업성 염증질환 등 유해화학물질 관련 직업병의 효과적인 예방 ○ 국내외 관련 학술지 게재 및 국내외 관련학회 발표 5.중 심 어 항산화(Anti-oxidation),직업성 심장질환(Occupationalheartdisease),산화적 DNA 손상(Oxidative DNA damage), 유전자 발현(Geneexpression),조절(Regulation)
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